Bardzo tanie apteki z dostawą w całej Polsce kupic levitra i ogromny wybór pigułek.

Bez tytu³u-

Zastosowanie technologii interferencji RNA w medycynie Application of RNA interference in medicine Marta Gabryelska1, Eliza Wyszko1, Stanis³aw Nowak2, Ryszard ¯ukiel2, Jan Barciszewski1 2 z Katedry i Kliniki Neurochirurgii i Neurotraumatologii genny RNA, np. wirusowy (18). Dlatego w³aœnie RNAi Interferencja RNA nale¿y do technik anty-mRNA ada- mo¿e funkcjonowaæ jako specyficzny stra¿nik genomu ptowanych do celów terapeutycznych. Ma potencjalne oraz regulator ekspresji genów (18). Zjawisko interferen- zastosowanie w leczeniu chorób wirusowych, nowotwo- cji RNA badano u A. thaliana, S. pombe, S. cerevisiae, rowych, neurodegeneracyjnych i innych. Wykorzystanie D. melanogaster, C. elegans, N. crassa, M. musculus, RNAi zale¿y od trwa³oœci wyciszenia docelowego genu, H. sapiens oraz wielu innych organizmach (1). Mimo ³atwoœci dostarczenia siRNA do chorej tkanki z zachowa- wielu podobieñstw wystêpuj¹ drobne ró¿nice miedzy or- niem jej aktywnoœci oraz brakiem efektów ubocznych.
ganizmami. Dotycz¹ one roli tego procesu w komórkach, Obecnie prowadzone s¹ liczne badania kliniczne spraw- rozprzestrzeniania siê sygna³u wyciszania, obecnoœci dzaj¹ce skutecznoœæ i bezpieczeñstwo terapii opartej na okreœlonych komponentów maszynerii RNAi oraz mo¿- tej technologii. Wiele firm farmaceutycznych i biotechno- liwoœci ich wykorzystania (18, 19).
logicznych pracuje nad komercjalizacj¹ zastosowañ RNAi.
W 2001 roku przeprowadzono pierwsze eksperymenty z wykorzystaniem siRNA w komórkach ssaków, a tak¿e pojawi³y siê doniesienia o efektach ubocznych tej tech- RNA interference is one of anty-mRNA techniques, niki (62). Nie zmieni³o to jednak faktu, ¿e interferencja adapted for a therapeutic purpose. It can be used for treat- RNA jest bardzo obiecuj¹c¹ metod¹ wyciszania genów ment of cancer, viral, neurodegenerative or other diseases.
ciesz¹c¹ siê wielkim zainteresowaniem zarówno w ba- Therapeutic applications of RNAi depend on persistent gene daniach podstawowych jak i w biotechnologicznych za- silencing and lack of side effects. Clinical trials are in progress, checking an effectiveness and safety of RNAi.
Many pharmaceutical and biotechnological companies are seeking for commercial application of that technology.
Konwencjonalne metody terapeutyczne maj¹ na celu zahamowanie syntezy lub aktywnoœci biologicznej da- S³owa kluczowe: interferencja RNA, inhibicja ekspre- nej cz¹steczki, bia³ka strukturalnego, enzymu lub recep- sji genów, badania kliniczne, gen docelowy, efekty uboczne tora. Wp³yw dowolnego terapeutyku na komórkê mo¿e Key words: RNA interference, gene epression inhibi- dotyczyæ transkrypcji docelowego genu, etapu potran- skrypcyjnego lub potranslacyjnego. Prze³omem w poszu- kiwaniu nowych preparatów medycznych okaza³y siê wykonane 30 lat temu badania antysensownych kwasów Organizmy eukariotyczne maj¹ naturalny mechanizm nukleinowych. Nieco póŸniej pojawi³y siê trójniciowe obronny w postaci interferencji RNA (ang. RNA interfe- kompleksy (3), rybozymy oraz aptamery i 10 lat temu in- rence, RNAi). Jest to proces, w którym d³ugie odcinki terferencja RNA. Systematyczne wyciszanie kolejnych dwuniciowych RNA ulegaj¹ hydrolizie do krótkich du- produktów genów przy pomocy RNAi mo¿e byæ pomoc- pleksów RNA o d³ugoœci 21 do 28 nukleotydów oraz in- ne w znalezieniu genu krytycznego dla wzrostu komórek dukuj¹ swoist¹ degradacjê jednoniciowych RNA (ang.
rakowych, a mniej istotnego dla proliferacji komórek zdro- single stranded RNA, ssRNA), takich jak mRNA lub egzo- wych (39). Jego identyfikacja u³atwi zaprojektowanie Tabela 1. Charakterystyka kwasów nukleinowych wykorzystywanych do inhibicji mRNA (5). PNA – ang. peptide nucleic acid, LNA – ang. locked nucleic acid.
Jednoniciowe; 16-30 nukleotydów Dwuniciowe; 19-21 nukleotydów RNAi, które mo¿e byæ wykorzystane przeciwko dowol- œwiadczalnej ma³py œlepotê, prawdopodobnie z powodu nemu czynnikowi patologicznemu, zarówno endogen- zbyt wysokich dawek, natomiast inny lek z tej grupy nie nemu jak i egzogennemu. W odniesieniu do chorób o zde- hamowa³ rozwoju nowotworu u chorych z zaawanso- finiowanej etiologii przeprowadzono badania z wykorzy- wanym rakiem piersi (66). Dotychczas ¿aden lek oparty staniem RNAi in vitro i in vivo w organizmach modelo- na katalitycznych RNA nie zosta³ wprowadzony do prak- tyki medycznej i zatwierdzony przez FDA (ang. Food and Interferencyjny RNA obok rybozymów, deoxyrybozy- Drug Administration) (56). Etap badañ klinicznych osi¹- mów i antysensownych oligonukleotydów zalicza siê do gnê³y dotychczas preparaty Angiozyme (Faza II) oraz technologii anty-mRNA (tab. 1). Antysensowne oligonu- kleotydy (ang. antisense-oligodeoxynucleotides, AS-ON), Pierwsze zastosowania RNAi wzbudzi³y wielki entu- s¹ to ³añcuchy (10-20 nukleotydowe) komplementarne zjazm, jakiego naukowcy nie doœwiadczyli wczeœniej do docelowego mRNA (38). Wiêkszoœæ z nich aktywuje w przypadku innych metod (39). Jednak¿e jej powodze- RNazê H, która hydrolizuje niæ RNA w utworzonych he- nie jako nowej techniki terapeutycznej bêdzie zale¿a³o terodupleksach DNA-RNA. Inne AS-ON, nie aktywuj¹ce g³ównie od mo¿liwoœci wprowadzenia nie zdegradowa- RNazy H, powoduj¹ zahamowanie translacji poprzez nego leku do chorych komórek, który musi byæ wystar- blokowanie rozpoznania przez rybosom (38). Dotychczas czaj¹co trwa³y, aby wyciszyæ mRNA (66). Ka¿dy lek oparty tylko jeden lek oparty na AS-ON (Vitravene) wykorzysty- o RNAi musi byæ zatem stabilny, selektywny, nietoksycz- wany jest w leczeniu choroby oczu wywo³anej przez ny, móc pokonaæ barierê w postaci b³on komórkowych cytomegalowirusy (CMV) u pacjentów z AIDS (38, 56).
i nie powodowaæ negatywnego wp³ywu na organizm (64).
Jednak nowsza metoda leczenia AIDS HAART (ang. Hi- ghly Active Anti-Retroviral Therapy) skutecznie zapobie- ga zapaleniom siatkówki i popyt na lek DNA jest ograni- Oczywistym celem ograniczenia ekspresji genów z wy- czony (66). Innym terapeutykiem typu AS-ON jest prepa- korzystaniem technologii RNAi s¹ wirusy stanowi¹ce po- rat Genasense, obni¿aj¹cy poziom bia³ka Bcl-2 (56).
wa¿ne zagro¿enie dla cz³owieka, miedzy innymi wirus HIV Rybozymy s¹ katalitycznymi cz¹steczkami RNA, któ- (ang. human immunodeficiency virus), wirusy grypy (ang.
re swoiœcie hydrolizuj¹ mRNA i uniemo¿liwiaj¹ syntezê influenza virus), wirusowego zapalenia w¹troby typu B kodowanego przez niego bia³ka. Praktyczne zastosowa- (ang. hepatitis B virus, HBV) i C (HCV), wirusy polio (ang.
nie rybozymów zosta³o poddane w w¹tpliwoœæ, ponie- poliovirus), brodawczaka (ang. human papilloma virus, wa¿ rybozymowy lek na ¿ó³taczkê typu C wywo³a³ u do- HPV), wirusy herpes (ang. herpes simplex virus, HSV), Tabela 2. Wybrane przyk³ady inhibicji infekcji wirusowych za pomoc¹ interferencji RNA. NP – bia³ko nukleokapsydu, PA – sk³adnik transkryptazy RNA wirusa grypy, bia³ko 94 kDa, U38 - polimeraza DNA, UL27 - glikoproteina, UL29 – bia³ko wi¹¿¹ce DNA, UL54 – polimeraza DNA, Env – poliproteina otoczki wirusa, Tat – transaktywator transkrypcji, Rev – bia³ko regulatorowe, Zta – czynnik transkrypcyjny, TRS – sekwencja reguluj¹ca transkrypcjê, Spike – bia³ko otoczki, PBMCs - ang. peripheral blood mononuclear cells, jednoj¹drzaste komórki krwi obwodowej (limfocyty, monocyty).
rotawirusy, RSV (ang. respiratory syncytial virus), cytome- noœæ takie jak specyficzne receptory komórkowe czy galowirusy (ang. human cytomegalovirus, HCMV), wirus czynniki transkrypcyjne (64). G³ównym problemem w le- West Nile i wiele innych (64). Wiele badañ in vitro oraz in czeniu chorób infekcyjnych jest opornoœæ na stosowane vivo, maj¹cych na celu inhibicjê ekspresji wirusowych leki. Dotyczy to zw³aszcza szybko mutuj¹cych wirusów.
genów, przynios³o jednoznaczne wyniki wskazuj¹ce na Wydaje siê zatem, ¿e inhibicja wirusa wieloma interferu- mo¿liwoœæ hamowania replikacji wirusów (tab. 2).
j¹cymi RNA jednoczeœnie skierowanymi przeciwko ró¿- Jako geny docelowe u wirusów wymienia siê te zaan- nym regionom genomu zmniejsza jego szanse na unik- ga¿owane w replikacjê i sk³adanie cz¹stek wirusowych, niêcie efektu RNAi poprzez spontaniczne mutacje (64).
specyficzne sekwencje ich genomów oraz transkrypty Ludzkie wirusy wykszta³ci³y pewn¹ formê ochrony komórkowe gospodarza u³atwiaj¹ce inwazjê lub patogen- genomu przed efektem RNAi, opart¹ o oddzia³ywania Tabela 3. Wybrane przyk³ady terapii chorób nowotworowych za pomoc¹ RNAi. E6, E7 – regulatory replikacji wirusa, EGFR – receptor czynnika wzrostu naskórka, XIAP – zwi¹zany z chromosomem X inhibitor apoptozy, K-ras – regula- tor cyklu komórkowego, COX-2 - cyclooksygenaza-2, Bcr-abl – bia³aczkowy gen fuzyjny.
pomiêdzy kapsydem a genomem (58). Nukleokapsyd apoptozy (APOP) (50). Wœród wyciszanych genów znaj- wirusa miêsaka Rous’a (ang. Rous sarcoma virus) os³ania duj¹ siê geny wirusowe, onkogeny, geny fuzyjne, geny wprowadzany wirusowy RNA przed degradacj¹, a koñ- opornoœci wielolekowej (ang. multidrug resistance, MDR) cowy efekt RNAi zale¿y od wybranego docelowego frag- (32), regulatory proliferacjii i inne (tab. 3).
mentu RNA (64). Podobny rodzaj supresji RNAi jest ob- Obecnoœæ mechanizmu RNAi potwierdzono tak¿e serwowany w przypadku wirusa RSV (ang. respiratory u Trypanosoma brucei, Plasmodium falciparum, Toxopla- syncytial virus), gdzie genom mo¿e byæ niedostêpny dla sma gondii, Paramecium, Leichmania donovanii (1). Jest siRNA z powodu utworzenia kompleksu z bia³kiem (45).
to istotne poniewa¿ pierwotniaki s¹ Ÿród³em wielu chorób Podobna sytuacja dotyczy innych wirusów, np. HIV. Z te- (64). Wyzwanie dla interferencji RNA stanowi¹ tak¿e cho- go powodu proces degradacji docelowego RNA musi roz- roby wywo³ane przez takie czynniki jak cukrzyca, czy oty- pocz¹æ siê w odpowiednim momencie cyklu rozwojo- ³oœæ (tab. 4), choroby wywo³ane przez mutacje punktowe, wego wirusa, kiedy jego genom bêdzie dostêpny.
choroby neurodegeneracyjne oraz zwi¹zane ze zmienn¹ Do g³ównych markerów biochemicznych zaanga¿o- liczb¹ powtórzeñ mikrosatelitarnych. Du¿a dok³adnoœæ wanych w powstawanie nowotworów zalicza siê recep- i skutecznoœæ dzia³ania siRNA umo¿liwia leczenie chorób tor bia³kowej kinazy tyrozynowej (ang. protein tyrosine wywo³anych przez mutacje punktowe, insercje czy dele- kinase, PTK), gruczolakowatej polipowatoœci coli (ang.
cje zidentyfikowanych genów (18). Olbrzymim wyzwaniem adenomatous polyposis coli, APC), onkogen Gli (ang. glio- s¹ choroby, u których pod³o¿a le¿y alternatywny splicing, ma-associated oncogene, Gli), fosfoinozytolow¹ kinazê który w oko³o 70%-90% prowadzi do powstania bia³ek 3 (ang. phosphoinisitide 3-kinase, PIK3), szlak transduk- o zmienionych funkcjach (20). Do chorób tych zaliczane cji bia³ek SMAD, czynnik transkrypcyjny indukuj¹cy nie- s¹ miêdzy innymi demencja czo³owo-skroniowa (ang. fron- dotlenienie (ang. hypoxia-inducible transcription factor, totemporal dementia), parkinsonizm zwi¹zany z chromo- HIF), retinoblastoma (ang. retinoblastoma, Rb) oraz szlak somem 17, niedobór hormonu wzrostu i inne (20).
Tabela 4. Terapia innych chorób za pomoc¹ RNAi; berghepain-1 i 2 – proteaza cysteinowa, DHODH – dehydrogenaza dihydroorotowianu, PEPCK – karboksykinaza fosfoenolo-pirogronianowa, AGRP - agouti-related peptide, SOD1 – dys- mutaza ponadtlenkowa, Htt - IT15, huntingtyna.
cz¹steczek jest ograniczone ze wzglêdu na nietrwa³y efekt Jak podkreœlono wczeœniej terapeutyczne zastosowa- wyciszenia, który zale¿y od tempa podzia³ów komórko- nie RNAi zale¿y od trwa³oœci wyciszenia, ³atwoœci roz- wych, komórki ssaków nie maj¹ systemu powielania RNAi przestrzeniania siê siRNA w obrêbie chorej tkanki, ich ak- (jak w przypadku C. elegans i roœlin) (26).
tywnoœci biologicznej, a tak¿e brak efektów ubocznych.
W badaniach procesu interferencji RNA istotna jest siRNA uwa¿a siê za skuteczny, je¿eli w stê¿eniu 1-20 nM odpowiednia linia komórkowa, je¿eli doœwiadczenia na prowadzi do efektywnego i specyficznego wyciszenia 90% ¿ywym organizmie s¹ utrudnione lub niemo¿liwe. Ko- (47). Ró¿nice w efektywnoœci siRNA, skutecznoœci trans- mórki takie musz¹ byæ ³atwe w hodowli, ³atwo ulegaæ fekcji, rodzaju wykorzystanej linii komórkowej i stabilno- transfekcji oraz posiadaæ nisk¹ wra¿liwoœæ na ewentual- œci bia³ek mog¹ wp³ywaæ na osi¹gniêty efekt RNAi (45).
ne modyfikacje chemiczne dostarczanych cz¹steczek siR- Nale¿y pamiêtaæ, ¿e rezultaty uzyskane w badaniach in NA. Bardzo czêsto wykorzystuje siê komórki nowotwo- vitro nie ³atwo przek³adaj¹ siê na wyniki otrzymane in vivo.
rowe ze wzglêdu na ich ³atwe namna¿anie (tab. 5), cho- Rolê induktora wyciszania (ang. trigger) w przypadku cia¿ nie wszystkie typy schorzeñ s¹ reprezentowane przez ssaków skutecznie spe³niaj¹ dwuniciowe shRNA (ang.
short hairpin RNA) lub siRNA (ang. short interfering RNA) Przylegaj¹ce do pod³o¿a linie komórkowe, takie jak o d³ugoœci 20 do 23 nukleotydów, zawieraj¹ce niesparo- HeLa i U2OS umo¿liwiaj¹ ³atwy, efektywny sposób wpro- wane 2 nukleotydy przy koñcu 3' (60). U ssaków d³ugie wadzenia cz¹steczek interferencyjnego RNA oraz szyb- cz¹steczki dsRNA indukowa³y interferon (60). W przy- ki, silny wzrost w dobrze zorganizowanych pojedynczych padku innych grup organizmów oraz niektórych linii ko- warstwach, co u³atwia obserwacjê mikroskopow¹ (15).
mórkowych (np. ES, P19) mo¿liwe jest u¿ycie dsRNA bez Wtórne linie komórkowe nie s¹ odpowiednikami ludz- indukcji odpowiedzi immunologicznej (68). Doœwiadcze- kich komórek chorobowych i dlatego trudno porówny- nia z komórkami linii embrionalnej (ang. embryonic stem waæ badania na nich wykonywane. Efektywnoœæ trans- cells, ES) czy linii potworniakorakowej P19 (ang. terato- fekcji pierwotnych linii komórkowych wynosi mniej ni¿ carcinoma cells) s¹ trudne ze wzglêdu na opornoœæ na kilka procent. Skutecznoœæ zale¿y nie tylko od typu ko- transfekcjê (68). siRNA charakteryzuje siê wysok¹ efek- mórek, ale tak¿e od liczby pasa¿y i stopnia konfluencji tywnoœci¹ wprowadzenia do komórki oraz mo¿liwoœci¹ komórek (45). Wiele linii komórkowych wykazuje tak¿e osi¹gniêcia tam wysokiego stê¿enia. Zastosowanie takich genetyczn¹ niestabilnoœæ, co prowadzi do utraty klonal- Tabela 5. Linie komórkowe wykorzystywane w badaniach noœci oraz zmian kariotypu i fizjologii (15). W zale¿noœci wyciszania genów przez siRNA (68, 63).
od podatnoœci komórek na transfekcjê proponowane s¹ ró¿ne rozwi¹zania metodyczne (ryc. 1).
Wstêpne badania skutecznoœci interferencji RNA w uk³adach komórkowych pozwalaj¹ oceniæ stosowane cz¹steczki siRNA lub shRNA. Zaproponowano dwufunk- cjonaln¹ konstrukcjê siRNA-DNA zwan¹ „crook” siRNA (34). Umo¿liwia ona wykrywanie bardzo niskiego pozio- mu siRNA efektywnego dla RNAi, pobranej przez komórki iloœci siRNA, lokalizacji komórkowej, rozprowadzenia do tkanek, a tak¿e farmakokinetyki. W „crook” siRNA do koñca 3’ sensownej nici siRNA do³¹czona jest struktura DNA typu „spinka do w³osów” odporna na dzia³anie nu- kleaz (34). Umo¿liwia to zarówno efektywne wyciszanie genów jak i amplifikacjê PCR, przy minimalnej wykry- Dla skutecznego zastosowania lub efektywnego bada- nia procesu interferencji niezbêdny jest wybór odpowied- niego celu molekularnego (mRNA) o znanej sekwencji. Jego wyciszenie powinno daæ widoczny lub mo¿liwy do ob- serwacji efekt. W niektórych doœwiadczeniach in vitro pokazano efekty uboczne zwi¹zane z wielokierunkowym dzia³aniem siRNA. Dla ich unikniêcia dany gen nie powi- Ludzkie komórki nab³onka ¿y³y pêpkowej nien zawieraæ wielu sekwencji homologicznych. Celowe jest skorzystanie z baz danych sekwencji genomowych BLAST (NCBI Unigene, EST, Celera) dla weryfikacji popraw- noœci celu RNAi (47). Dostêpne s¹ algorytmy u³atwiaj¹ce projektowanie skutecznych siRNA (tab. 6). Wprowadza- j¹c tam numer dostêpu (ang. accession number) lub se- kwencjê genu koduj¹cego cel terapeutyczny, otrzymuje- my listê kompatybilnych oligonukleotydów. Wielu sku- tecznych siRNA nie mo¿na jednak przewidzieæ tylko na podstawie analizy in silico. Wszystkie mo¿liwe sekwen- cje okreœlonej d³ugoœci powinny byæ analizowane w li- niach komórkowych dla upewnienia, czy wszystkie siR- NA zosta³y zidentyfikowane (67). Jest to bardzo kosztow- ne. £atwiejsz¹ alternatywê stanowi stworzenie genowo- specyficznej biblioteki siRNA poprzez przygotowanie Tabela 6. Adresy internetowe wybranych algorytmów do projektowania siRNA.
http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html http://www.rnaiweb.com/RNAi/siRNA_Design/index.html http://hydra1.wistar.upenn.edu/Projects/siRNA/siRNAindex.htm https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai?op=help http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://i.cs.hku.hk/~sirna/software/sirna.php http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ http://203.199.182.73/gnsmmg/databases/sirna/dstho.html http://itb1.biologie.hu-berlin.de/~nebulus/sirna mieszaniny cz¹steczek o mo¿liwej sekwencji, ekspresji o d³ugoœci poni¿ej 30 par zasad (60). W przypadku d³u¿- w liniach komórkowych, selekcji wybranych fenotypów szych cz¹steczek mo¿liwa jest aktywacja odpowiedzi i na tej podstawie identyfikacji skutecznej sekwencji interferonowej, prowadz¹cej do apoptozy. Nastêpuje aktywacja szlaku Jak-Stat (ang. Janus kinase - signal trans- ducers and activators of transcription) oraz wzrostu po- ziomu ekspresji genów stymulowanych interferonem (in- Warunkiem bezpiecznego wykorzystania RNAi w te- terferon-stimulated genes, ISGs) (63). Transfekcja siRNA rapii jest brak efektów ubocznych (ang. off-target effects).
swoistego dla GAPDH powodowa³a co najmniej dwu- siRNA mo¿e funkcjonowaæ jako miRNA i na odwrót, krotny wzrost ekspresji 52 genów ISG (63). W wiêkszoœci wykazuj¹c wieloraki wp³yw na ekspresjê genów (33).
przypadków poziom ekspresji zale¿ny by³ od iloœci do- Wykorzystanie ró¿nych siRNA dla jednego docelowego starczonego siRNA, przy stê¿eniu 100 nM powoduj¹c mRNA mo¿e powodowaæ uzyskanie ró¿nych niespecy- ponad dziesiêciokrotny wzrost ekspresji. D³ugi RNA ficznych wzorców ekspresji dla ka¿dej z u¿ytych cz¹ste- o strukturze spinki do w³osów (ang. long-hairpin RNA, czek. Mimo ¿e jedn¹ z cech RNAi jest specyficznoœæ, lhRNA), ulegaj¹cy ekspresji w komórkach ssaków z wek- efekty „off-target” stanowi¹ potencjalny problem. Nadal tora plazmidowego nie indukowa³ odpowiedzi immuno- nieznane s¹ parametry okreœlaj¹ce minimalny poziom logicznej (37). Aktywacja uk³adu immunologicznego przez homologii niezbêdny do efektywnego i bezpiecznego siRNA i zwi¹zana z tym toksycznoœæ s¹ zale¿ne od se- wyciszania genów (69). Efektów ubocznych nie obser- kwencji nukleotydowej (35). Zidentyfikowano immunosty- wowano, gdy wprowadzano dsRNA do organizmów pry- muluj¹ce motywy bogate GU, co pozwala na zaprojekto- mitywnych. Wydaje siê, ¿e siRNA powstaj¹ce z dsRNA wanie siRNA, który mo¿e wyciszaæ gen, jednoczeœnie in- s¹ dok³adnie wybierane przez Drosha i Dicer oraz inne dukuj¹c minimaln¹ odpowiedŸ interferonow¹ (35).
komponenty endogennej maszynerii RNAi, które mog¹ Przypuszcza siê, ¿e stymulacja odpowiedzi immuno- mieæ aktywnoœæ korekcyjn¹, która zabezpiecza przed logicznej wywo³ana obecnoœci¹ obcego RNA zachodzi niespecyficznym wyciszaniem (14). siRNA powstaj¹cy z udzia³em dwóch typów bia³ek: transmembranowych z prekursora dsRNA w wyniku dzia³ania kompleksów en- receptorów TLR (ang. Toll-like receptor) oraz cytoplazma- zymatycznych w komórkach ssaków indukuje niespecy- tycznych receptorów typu PKR (ang. protein kinase R) i pro- ficzne efekty w znacznie mniejszym stopniu. Wi¹¿e siê duktu genu RIG-1 (ang. retinoic acid-inducible gene 1), to w tym przypadku z odpowiedzi¹ interferonow¹ (14).
(ryc. 2) (61). TLR znajduj¹ siê na b³onie komórkowej oraz D³ugie dsRNA efektywnie wyciszaj¹ geny w komór- w innych wewn¹trzkomórkowych kompartmentach.
kach owadów i komórkach embrionalnych ssaków, nie W endosomach siRNA zawieraj¹cy motyw immunosty- aktywuj¹c uk³adu immunologicznego (68). Do dojrza³ych muluj¹cy aktywuje TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9, co prowa- komórek ssaków wprowadziæ mo¿na wy³¹cznie siRNA dzi do uaktywnienia czynników transkrypcyjnych NF-ê , Rycina 2. OdpowiedŸ komórki na wprowadzenie ró¿nych typów dsRNA. A. Wektor wirusowy zawieraj¹cy sekwencjê shRNA inte- gruje z genomem i ulega transkrypcji. Powsta³y shRNA jest transportowany do cytoplazmy przez eksportynê-5, hydrolizowany przez Dicer do siRNA zawieraj¹cego niesparowane koñce i prowadzi do specyficznej degradacji docelowego mRNA. OdpowiedŸ immu- nologiczna nie ma miejsca, gdy¿ zosta³y wykorzystane naturalne mechanizmy RNAi. B. Syntetyczny siRNA dostarczony do organi- zmu w zawiesinie liposomalnej, dostaje siê do endosomu, gdzie aktywuje receptory TRL, co prowadzi do transdukcji sygna³u do j¹- dra komórkowego i ekspresji genów cytokin zapalnych i interferonu. siRNA zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy koñcu 3’ mo¿e wejœæ na szlak RNAi, a siRNA ze sparowanymi koñcami aktywuje odpowiedŸ immunologiczn¹. C. Wprowadzony do ko- mórki d³ugi dsRNA aktywuje kinazê bia³kow¹ PKR i RNazê L, co prowadzi do degradacji RNA i zablokowania inicjacji translacji, a w konsekwencji do apoptozy. TLR – ang. Toll-like receptor, PKR – kinaza bia³kowa zale¿na od dsRNA, RIG-1 – ang. retinoic acid- inducible gene I, EIF2 – podjednostka czynnika inicjacji translacji.
IRF-3 oraz IRF-7, które stymuluj¹ ekspresjê genów IFN.
prowadzi do ca³kowitego zablokowania syntezy bia³- Helikazowa domena bia³ka RIG-1 w cytoplazmie rozpo- ka. Komórka kierowana jest na drogê apoptozy. Wi¹- znaje dsRNA, a pozosta³e domeny aktywuj¹ szlak pro- zanie dsRNA przez syntazê 2',5'-oligoA powoduje jej wadz¹cy do syntezy interferonu i cytokin zapalnych (61).
aktywacjê i syntezê oligonukleotydów adenylowych siRNA zawieraj¹cy dwa niesparowane nukleotydy przy (pppA(2’p5’A) ), które aktywuj¹ RNazê L, powoduj¹c¹ koñcu 3’ nie aktywuje bia³ka RIG-1, w odró¿nieniu od degradacjê RNA (45). Chemiczne cechy dsRNA, poziom siRNA nie zawieraj¹cego niesparowanych koñców (44).
ekspresji lub dawki oraz sposób dostarczenia RNA do Tak¿e shRNA ulegaj¹ce ekspresji z wektora nie aktywuj¹ komórki mog¹ wp³ywaæ na poziom aktywacji odpowie- odpowiedzi interferonowej. Natomiast reakcjê tê stymu- luje syntetyczny siRNA dostarczony za pomoc¹ noœnika Istnieje mo¿liwoœæ wspó³zawodnictwa egzogennych lipidowego (55). Modyfikacja chemiczna siRNA mo¿e siRNA z endogennymi miRNA o dostêp do RISC (ang.
utrudniæ rozpoznanie przez TLR, co u³atwi³oby stosowa- RNA-induced silencing complex). miRNA odgrywaj¹ rolê nie siRNA bez wzbudzania odpowiedzi immunologicz- regulatorów ekspresji genów. Zaburzenie ich funkcjono- wania mo¿e powodowaæ komplikacje terapeutyczne.
Aktywacja kinazy bia³kowej PKR nastêpuje po zwi¹- W niektórych przypadkach nadekspresja genów miR zaniu dsRNA. Hamuje ona translacjê na skutek fosforyla- mo¿e prowadziæ do onkogenezy, z kolei w komórkach cji podjednostki czynnika inicjacji translacji EIF2 , co nowotworowych obserwowano zredukowany poziom niektórych miRNA (69). Obni¿enie iloœci stosowanego przez Dicer oraz efektywniejszym wprowadzeniem do siRNA mo¿e przyczyniæ siê do obni¿enia ryzyka wyst¹- RISC (2). Istnieje zale¿noœæ skutecznoœci disRNA od wy- pienia efektów niespecyficznych (28). siRNA wykazuj¹- ciszanego genu. dsRNA o d³ugoœci oko³o 200 nukleoty- cy pe³n¹ komplementarnoœæ do docelowego genu mo¿e dów skutecznie wycisza³ gen tenascyny-C (TN-C) in vitro powodowaæ, oprócz degradacji w³aœciwego mRNA, tak- i in vivo (84). Strategiê oparto na za³o¿eniu, ¿e Dicer wi¹¿e ¿e spadek poziomu bia³ek w komórce (18). Zaprojekto- i hydrolizuje dsRNA do dupleksów o d³ugoœci 21-25 nu- wany siRNA, zawieraj¹cy trzy do czterech nukleotydów kleotydów, które po wprowadzeniu do RISC mog¹ zwie- niesparowanych z nukleotydami transkryptu docelowe- lokrotniæ efekt wyciszenia, poprzez wi¹zanie siê do wie- go inhibitora 1A kinazy zale¿nej od cyklin (ang. cyclin- lu miejsc mRNA wiêkszej iloœci cz¹steczek (84). Na po- dependent kinase inhibitor 1A, CDKN1A), wp³ywa³ g³ów- dobnej zasadzie projektowano d³ugi RNA o strukturze nie na poziom bia³ek, w sposób podobny do miRNA (33).
spinki do w³osów (long-hairpin RNA, lhRNA) w celu wy- Badano wp³yw d³ugotrwa³ego wysokiego poziomu ciszenia genów wirusa HIV (37). Ekspresja lhRNA pro- ekspresji shRNA na w¹troby doros³ych myszy zbadano wadzi do powstania siRNA skierowanych przeciwko wielu stosuj¹c 49 ró¿nych wektorów AAV/shRNA, unikalnych regionom genu nef, co powodowa³o wydajniejsz¹ inhi- pod wzglêdem d³ugoœci i sekwencji przeciwko szeœciu genom docelowym (24). 36 spoœród nich powodowa³o W wektorach ekspresyjnych siRNA wykorzystywane powa¿ne uszkodzenia w¹troby zale¿ne od stosowanej s¹ g³ównie promotory polimerazy RNA III (Pol III) oraz II dawki, z czego 23 ostatecznie prowadzi³y do œmierci (Pol II). Ze wzglêdu na obfitoœæ komórkowych niekodu- ponad 150 zwierz¹t w ci¹gu 2 miesiêcy (12, 24). Zacho- j¹cych RNA – transkryptów Pol III, czêsto wykorzystuje rowalnoœæ by³a zwi¹zana z obni¿eniem iloœci endogen- siê promotory dla tej polimerazy w badaniach nad RNAi nych miRNA, wskazuj¹c na prawdopodobn¹ konkuren- w komórkach ssaków. Promotory te umo¿liwiaj¹ produk- cjê pomiêdzy miRNA i egzogennymi shRNA o ograni- cjê cz¹steczek RNA o cechach charakterystycznych dla czon¹ iloœæ czynników komórkowych zaanga¿owanych siRNA – nie zawieraj¹cych struktury cap przy koñcu 5' w funkcjonowanie RNAi (24). Elementem ograniczaj¹- oraz poliadenylowanego koñca 3'. Wœród promotorów cym funkcjonowanie miRNA jest eksportyna-5, ulegaj¹- Pol III do produkcji siRNA in vivo wykorzystuje siê pro- motor U6 genu ma³ych j¹drowych RNA (ang. small nuc- lear RNA, snRNA) oraz promotor H1 genu RNazy P (77).
Wprowadzanie cz¹steczek siRNA do komórek W przypadku promotora H1, istotn¹ zalet¹ jest uzyskiwa- siRNA mo¿na otrzymaæ in vitro, metod¹ syntezy che- nie transkryptów zawieraj¹cych niesparowane koñce 3'.
micznej, transkrypcji in vitro oraz poprzez trawienie d³u- Wykorzystywane s¹ równie¿ promotory typu II. W kilku gich dsRNA enzymami RNazaIII/Dicer. Mo¿liwa jest tak- przypadkach okaza³o siê, ¿e s¹ one efektywniejsze od pro- ¿e ich ekspresja in vivo. Regulacja ekspresji genów za motorów typu III oraz prowadz¹ do zagêszczenia siRNA pomoc¹ siRNA jest przemijaj¹ca i czêsto trwa przez 3-5 w cytoplazmie. Cz¹steczki ulegaj¹ce ekspresji z wykorzy- staniem promotorów U6 wystêpuj¹ g³ównie w j¹drze ko- Dla wyciszania genów w komórkach embrionalnych mórkowym. Dicer wykazuje wy¿sz¹ aktywnoœæ w cyto- Drosophila melanogaster najefektywniejsz¹ cz¹steczk¹ wy- plazmie i przetwarzanie shRNA w aktywny siRNA mo¿e ciszaj¹c¹ jest siRNA o d³ugoœci 21 nukleotydów i dwoma niesparowanymi nukleotydami przy koñcu 3’ (16). Dalsze Wykorzystanie promotorów Pol II poza pewnymi ty- badania wykaza³y, ¿e skutecznoœæ cz¹steczek siRNA wzra- pami komórek jest jednak bardzo ograniczone. Pol II sta wraz z d³ugoœci¹ dupleksu a¿ do 27pz (36). D³u¿sze uczestniczy w transkrypcji genów koduj¹cych bia³ka.
cz¹steczki charakteryzuje mniejsza skutecznoœæ (2).
Transkrypty maj¹ typowe modyfikacje koñców 3' i 5', ta- W mechanizmie interferencji RNA, dsRNA jest roz- kie jak struktura cap czy poli(A) Nie odpowiada to struk- poznawany i hydrolizowany przez Dicer w odpowied- turalnym wymaganiom siRNA. Z wyj¹tkiem kilku typów niej odleg³oœci od koñca helikalnego (42). Mo¿na wyko- komórek d³ugie dsRNA uzyskane dziêki promotorom Pol rzystaæ Dicer do wyboru i wyciêcia najbardziej efektyw- II, s¹ natychmiast transportowane do cytoplazmy, gdzie nej cz¹steczki siRNA z wprowadzonej do komórki nici indukuj¹ odpowiedŸ interferonow¹ (77). Uda³o siê uzy- shRNA lub dsRNA. Istnieje mo¿liwoœæ zaprojektowania skaæ efekt wyciszenia z u¿yciem wektorów, zawieraj¹- „disRNA” (ang. Dicer–substrate siRNA), który po hydroli- zie przez Dicer dawa³by specyficzne siRNA o d³ugoœci Ekspresja dwuniciowych RNA w komórkach mo¿liwa 21 nukleotydów. Uzyskane cz¹steczki disRNA powodo- jest na dwóch drogach. Pierwsza oparta jest o syntezê wa³y maksymaln¹ inhibicjê ekspresji genów przy ni¿szych dwóch komplementarnych nici siRNA o d³ugoœci 21-23 stê¿eniach, a wyciszenie trwa³o d³u¿ej (2). Spowodowa- nukleotydów z dwóch ró¿nych promotorów U6, z kaset ne jest to prawdopodobnie rozpoznaniem i hydroliz¹ zlokalizowanych tandemowo na tym samym wektorze Tabela 7. Mechanizmy indukcji ekspresji shRNA. DSE - ang. distal sequence element; Dox - doksycyklina; GAL4 - N- koñcowy fragment transkrypcyjnego aktywatora dro¿d¿y; KRAB - rodzina transkrypcyjnych represorów zwi¹zanych z Kruppel box; PSE - ang. proximal sequence element; RXR - receptor Retinoidu X; tetO - operator tetracyklinowy; tTR - bia³ko represorowe tetracykliny; VgEcR - zmodyfikowany receptor ekdyzonu, neo - neomycyna.
Sekwencja tetO zlokalizowana bezpoœrednio poni¿ej TATA box.
W nieobecnoœci Dox, tTR wi¹¿e siê do tetO i hamuje transkrypcjê shRNA.
Dodanie Dox powoduje dysocjacjê tTR, co prowadzi do aktywacji jednostki Wiele sekwencji tetO znajduje siê pomiêdzy elementami promotora Pol III – DSE i PSE oraz TATA box. Taka budowa poprawia kooperatywne wi¹zanie tTR do sekwencji tetO i jednoczeœnie blokuje komunikacjê pomiêdzy ka¿dym z tych elementów. Dox powoduje dysocjacjê tTR, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA U¿ycie bia³ka hybrydowego tTR-KRAB, kontrolowanego tetracyklin¹.
W nieobecnoœci Dox, tTR-Krab wi¹¿e siê do tetO i hamuje transkrypcjê shRNA. Dodanie Dox powoduje dysocjacjê tTR-KRAB, co prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i ekspresji shRNA Obejmuje trzy wektory retrowirusowe: ekspresja dwóch z nich prowadzi do syntezy dwóch czynników transkrypcyjnych VgEcR i RXR, a trzeciego do syntezy produktu genu po³¹czonego Gal4, bêd¹cego poœrednim aktywatorem, pozostaj¹cego pod kontrol¹ indukowalnego promotora.
Ekdyzon powoduje dimeryzacjê czynników transkrypcyjnych i wi¹zanie siê ich do indukowalnego promotora, co aktywuje aktywator poœredni GAL4. £¹czy siê on do czterech miejsc wi¹zania GAL4 w DNA, aktywuj¹c promotor U6, co prowadzi do aktywacji jednostki U myszy transgeniczej nie dochodzi do ekspresji U6-ploxPneo-Fgfr2 i wyciszenia genu Fgfr2. Promotor U6 jest nieaktywny z powodu insercji sekwencji neo. Po skrzy¿owaniu z mysz¹, u której w linii komórek rozrodczych dochodzi do ekspresji Cre, dochodzi do wyciêcia neo Promotor H1 ma wprowadzony operator lac. Zastosowanie w transgenicznych liniach komórkowych, w których ekspresji ulega represor lac.
Po zastosowaniu IPTG, represor lac oddysocjowuje i mo¿liwa jest transkrypcja.
lub na dwóch ró¿nych plazmidach (77). Drugi sposób ¿e tRNA-shRNA, ulegaj¹cy ekspresji z wykorzystaniem wymaga u¿ycia jednego promotora, aby uzyskaæ ekspre- promotora ludzkiego genu dla tRNAVal prowadzi do spe- sjê siRNA o strukturze „spinki do w³osów” (shRNA), przy cyficznej inhibicji ekspresji genu fuzyjnego PML-RAR czym koniec 3' 19- do 21-nukleotydowej sekwencji po- zarówno in vitro jak i in vivo (49).
³¹czony jest z koñcem 5' komplementarnej sekwencji tej Badania wyciszania genów zwi¹zanych z cyklem ko- samej d³ugoœci poprzez pêtlê zawieraj¹c¹ 3 do 9 nukle- mórkowym, apoptoz¹ i rozwojem s¹ bardzo trudne. Hy- otydów (77). W obu przypadkach powstaj¹ dwuniciowe droliza mRNA krytycznego dla organizmu na danym eta- cz¹steczki siRNA, przy czym drugi sposób wymaga za- pie rozwoju mo¿e prowadziæ do zaburzeñ i uniemo¿liwiæ anga¿owania przez komórkê enzymu Dicer.
uzyskanie wyników na kolejnych etapach. Aby temu za- Istnieje mo¿liwoœæ uzyskania ekspresji shRNA zwi¹- pobiec mo¿na stosowaæ wektory, zawieraj¹ce promotory zanych z tRNA przy koñcu 3’, co zwiêksza efektywnoœæ warunkowe (ang. conditional promoters) (tab. 7, ryc. 3).
dostarczenia cz¹steczek do cytoplazmy (2). Wykazano, W tym celu wykorzystano promotory Pol III, pomimo ich nie wektorów wirusowych daje mo¿liwoœæ uzyskania sta- bilnego wyciszenia docelowego genu, w zwi¹zku z mo¿- liwoœci¹ integracji genomu wirusa z genomem gospoda- rza i d³ugotrwa³ej transkrypcji wyciszaj¹cego RNA. Wek- tory wirusowe ró¿ni¹ siê miêdzy sob¹ typem preferowa- nych komórek docelowych, ³atwoœci¹ zastosowania in Rycina 3. Zale¿noœæ syntezy siRNA od tetracykliny (Tet) lub do- vitro i in vivo, zdolnoœci¹ do integracji z genomem go- ksycykliny (Dox). TetR – represor tetracyklinowy; TetO – opera- spodarza lub jej brakiem, poziomem immunogennoœci oraz maksymalnym mo¿liwym rozmiarem insertu.
mniejszej wszechstronnoœci w porównaniu z Pol II. Tego Kontrola procesu interferencji RNA mo¿e byæ zreali- typu konstrukcje œciœle reguluj¹ transkrypcjê siRNA w ko- zowana w przypadku po³¹czenia cech wektorów wiru- mórkach, w których zachodzi przejœciowa lub stabilna sowych i systemów ekspresji siRNA opartych na promo- ekspresja represora Tet (TetR) (77). Sekwencja operatora torach warunkowych. W przeprowadzonych doœwiadcze- tertracyklinowego TetO umieszczona jest powy¿ej se- niach in vitro, równoczesna infekcja wektorem adenowi- kwencji promotorów H1, U6 lub 7SK. Przy³¹czenie siê rusowym, zawieraj¹cym system ekspresji siRNA pozosta- represora do operatora hamuje transkrypcjê. Tetracykli- j¹cy pod kontrol¹ promotora H1, zale¿nego od doksycy- na lub doksycyklina powoduj¹ dysocjacjê kompleksu, co kliny oraz wektorem adenowirusowym koduj¹cym repre- prowadzi do aktywacji jednostki transkrypcyjnej i eks- sor tetracyklinowy, doprowadzi³a do inhibicji ekspresji presji interferuj¹cego RNA. Wektory tego typu umo¿li- genów p53 i c-Myc w sposób zale¿ny od doksycykliny wiaj¹ kontrolê poziomu docelowego bia³ka poprzez re- i dawki wirusa (30). W ten sposób uda³o siê uzyskaæ po- gulacjê stê¿enia czynnika indukcyjnego. Trwaj¹ prace nad wykorzystaniem wektorów, w których ekspresja interfe- dsRNA mo¿e zostaæ wprowadzony do komórki na rencyjnego RNA zale¿na jest od dwóch czynników kon- drodze elektroporacji, mikroiniekcji, zanurzania organi- trolnych – ekdyzonu oraz produktu genu Gal4 (25). Pro- zmu w roztworze dsRNA, drog¹ pokarmow¹ lub z wyko- motory warunkowe Pol III umo¿liwiaj¹ regulacjê ekspre- rzystaniem wektorów plazmidowych lub wirusowych.
sji shRNA tkankowo- lub komórkowospecyficznej po- Metody te by³y stosowane w stosunku do ró¿nych orga- przez ekspresjê aktywatora GAL4 pozostaj¹cego pod kon- nizmów (1). Podanie myszy o wadze 20 g zastrzyku roz- trol¹ tkankowospecyficznych promotorów (47).
tworu siRNA o objêtoœci 1ml odpowiada iniekcji 3,5 l Wektory maj¹ce promotory warunkowe uda³o siê za- roztworu pacjentowi o wadze 70 kg (5). Istnieje mo¿li- stosowaæ w doœwiadczeniach in vitro. Pokazano kontro- woœæ wprowadzenia siRNA do organizmu drog¹ inhala- lowane wy³¹czenie genu DMNT1 (DNA metylotransfe- cji. Wprowadzony w ten sposób siRNA u myszy zahamo- raza-1) w ludzkich komórkach rakowych, prowadz¹ce wa³ infekcjê wywo³an¹ wirusami RSV (ang. respiratory syn- do zahamowania ich wzrostu, wyciszenia genu CXCR4 cytial virus) oraz PIV (ang. parainfluenza virus) (4, 79). Dla (receptor CXC4, zwi¹zany z ruchliwoœci¹) w komórkach lokalnego dostarczania cz¹steczek RNAi istotny jest wy- raka piersi, znacznego zahamowania ich przemieszcza- bór powierzchni wnikania terapeutyku. B³ony œluzowe nia; oraz do wy³¹czenia genu -kateniny w komórkach s¹ miejscem wnikania wielu czynników infekcyjnych, raka okrê¿nicy, uzyskuj¹c zahamowanie cyklu komór- dlatego wydaj¹ siê byæ doskona³ym celem dla RNAi (59).
kowego i wzrostu (47). Opisany system indukcyjny zo- Istnieje szansa na stworzenie leku opartego na technolo- sta³ tak¿e sprawdzony in vivo u myszy, u której wystêpo- gii RNAi bez koniecznoœci wykonywania zastrzyków, ale wa³y przerzuty nowotworu, przy czym ekspresja siRNA poprzez kontakt z b³on¹ œluzow¹ dróg oddechowych, nie podlega³a w tym przypadku tak œcis³ej regulacji jak rozrodczych, czy uk³adu pokarmowego.
w przypadku badañ in vitro na wyselekcjonowanych ko- W wiêkszoœci przypadków plazmidy ulegaj¹ przejœcio- Badania wyciszania genów RNAi wkroczy³y na etap wej ekspresji z wytworzeniem siRNA. Drugi typ noœni- badañ klinicznych. W fazie I eksperymentalny lek jest ków wykorzystywanych do uzyskania wyciszenia doce- testowany po raz pierwszy na ma³ej grupie ludzi (20-80 lowych genów stanowi¹ wektory wirusowe. W celu do- osób), w celu okreœlenia bezpiecznej dawki leku oraz starczenia do komórek ekspresyjnych kaset siRNA mo¿na identyfikacji efektów ubocznych. W fazie II badaniu pod- wykorzystaæ trzy rodziny cz¹steczek wirusowych: oparte lega wiêksza liczba osób stosuj¹cych dany lek (100-300).
na retrowirusach (zarówno onkowirusy jak i lentiwirusy), Celem tego etapu jest sprawdzenie efektywnoœci prepa- adenowirusach oraz wirusach AAV (ang. adeno-associa- ratu oraz dalsze sprawdzanie jego bezpieczeñstwa. Eks- ted viruses) (77), które do replikacji potrzebuj¹ wirusa wspo- perymentalny œrodek podawany wiêkszej grupie ludzi magaj¹cego (adenowirusa lub herpeswirusa). Zastosowa- (1000-3000) charakteryzuje fazê III badañ klinicznych.
Tabela 8. Badania kliniczne RNAi (5, 17). AMD – ang Age-related macular degeneration, degeneracja plamki ¿ó³tej, DMO – Diabetic macular oedema, cukrzycowy obrzêk plamki ¿ó³tej, IND – proœba do FDA o pozwolenie na testowa- Jej celem jest potwierdzenie jego efektywnoœci, monito- age-related macular degeneration, AMD) poprzez inhi- rowanie efektów ubocznych, porównanie z powszech- bicjê ekspresji genu VEGF (ang. vascular endothelial nie stosowanymi lekami oraz zbieranie informacji umo¿- growth factor). Obecnie w stanie nieuleczalnym AMD liwiaj¹cych w przysz³oœci bezpieczne jego stosowanie.
jest 1.65 milionów Amerykanów (57). Acuity Pharmaceu- W fazie IV zbierane s¹ dodatkowe informacje, ju¿ po ticals sugeruje, ¿e na œwiecie w roku 2013 na AMD bêdzie wprowadzeniu leku na rynek. Badania te dotycz¹ ryzyka chorowaæ 11 milionów ludzi (57). Badania przeprowadzo- stosowania leku, korzyœci oraz dawki optymalnej (75).
ne na grupie 129 pacjentów wskazuj¹, ¿e wstrzykniêty do Chorobotwórczy gen ApoB (apoliproteina B) zosta³ oka Bevasiranib redukuje wzrost naczyñ krwionoœnych, wyciszony u ma³p poprzez wprowadzenie siRNA do co nieznacznie poprawia wzrok (57). Przy niskich daw- krwiobiegu (9). siRNA specyficzny wobec ApoB w posta- kach efekt utrzymywa³ siê przez kilka miesiêcy, przy wy- ci cz¹stek SNALP (ang. stable nucleic acid lipid particles) ¿szych o wiele d³u¿ej. Nie obserwowano szkodliwych efek- podany w wysokiej dawce (1 i 2.5 mg kg–1) akumulowa³ tów ubocznych z wyj¹tkiem przewidywanej opuchlizny siê w w¹trobie po 48 godzinach powoduj¹c wyciszenie i stanu zapalnego w miejscu wstrzykniêcia leku (57). Nie- ponad 90% (83). Efekt utrzyma³ siê przez 11 dni, nie za- wykluczone, ¿e Bevasiranib jak i inne podobne terapeuty- obserwowano efektów toksycznych dla organizmu (9).
ki bêd¹ stosowane ³¹cznie z lekami przeciwnowotworo- Wprowadzenie systemiczne siRNA do zwierz¹t naczel- wymi, które tak¿e blokuj¹ efekty VEGF.
nych okaza³o siê skuteczne i bezpieczne, co daje nadziejê Pierwsze wyniki badañ klinicznych wydawa³y siê zgodne z teori¹. Pod wp³ywem leku dochodzi³o do efek- Firmy biotechnologiczne rozpoczê³y lub planuj¹ roz- tywnej redukcji rozmiarów nowotworów oraz iloœci cz¹- poczêcie badañ klinicznych leków opartych na techno- stek wirusowych u pacjentów (56). Dok³adna analiza logii RNAi (tab. 8). Badania dotycz¹ terapii chorób wiru- wyników wykazuje, ¿e uzyskane rezultaty spowodowa- sowych jak i wieloczynnikowych. Dotychczas prace ba- ne by³y raczej wzrostem produkcji interferonu przez uk³ad dawcze obejmuj¹ pierwsz¹ fazê badañ klinicznych. Kil- immunologiczny w odpowiedzi na obcy RNA, ni¿ spe- ka firm skupia siê na terapii degeneracji plamki ¿ó³tej (ang.
cyficznym wyciszeniem docelowych genów (56).
rynku odzwierciedlaj¹ czas zaadaptowania danej techni- Od czasu opisania istoty RNAi pod koniec ubieg³ego ki. Pierwsz¹ opracowan¹ metod¹ by³y oligonukleotydy wieku, technologia ta zosta³a szybko zaadaptowana w la- RNA, nastêpnie techniki oparte o wektory. Wzglêdnie nowy boratoriach badawczych. Interferencja RNA w odró¿nie- obszar stanowi lecznictwo, obejmuj¹ce zastosowanie RNAi niu od innych metod terapeutycznych wykorzystuje na- do odkrywania nowych leków. Przewiduje siê, ¿e dochód turalne elementy maszynerii komórkowej. siRNA w swym zwi¹zany z technologi¹ RNAi bêdzie systematycznie wzra- dzia³aniu przypominaj¹ katalizatory – jedna cz¹steczka sta³, osi¹gaj¹c w 2008 roku 185 milionów dolarów.
mo¿e wyciszyæ wiele cz¹steczek mRNA. Zapewnia to Szacuje siê, ¿e technologia RNAi obejmie oko³o 10% rynku leków, co oznacza miliardy dolarów zysków. Po- Od 1998 roku roczna liczba publikacji na temat RNAi mimo tego, ¿e zastosowanie RNAi budzi nadzieje w kil- wzros³a z kilkunastu do kilkuset (31). Aby RNAi by³o sku- ku przypadkach, wielu obserwatorów twierdzi, ¿e nie teczn¹ metod¹ terapeutyczn¹, nale¿y przezwyciê¿yæ trud- przejd¹ one pomyœlnie prób klinicznych i nie zostan¹ noœci natury technicznej oraz finansowej, co oznacza zatwierdzone w USA przez FDA przed rokiem 2008 lub, produkcjê leku przy racjonalnych kosztach (56).
co bardziej prawdopodobne, przed 2013 (31).
Interferencja RNA nie zosta³a jeszcze wykorzystana jako Odkrycie mo¿liwoœci zastosowania interferencji RNA metoda terapeutyczna, ale ju¿ teraz technologie RNAi przy- jako technologii terapeutycznej silnie zaanga¿owa³o prze- nosz¹ du¿e zyski. Rynek produktów opartych na RNAi – mys³. W badania RNAi w³¹czy³o siê ju¿ ponad 100 firm w tym siRNA, oligonukleotydy RNA i wektory DNA, ko- (66). Czêœæ z nich dostarcza odczynniki i rozwi¹zania duj¹ce siRNA – przyniós³ dochód w roku 2003 w wysoko- metodyczne niezbêdne do wykonania doœwiadczeñ, resz- œci 38 milionów dolarów (dane wed³ug Front Line Strate- ta to firmy biotechnologiczne lub farmaceutyczne poszu- gic Consulting, San Meteo, USA) (31) (ryc. 4). Rozmiary kuj¹ce komercyjnych zastosowañ RNAi (tab. 9).
Tabela 9. Firmy biotechnologiczne wykorzystuj¹ce technologiê RNAi (31).
Michael Tolentino i Samuel RNAi przeciwko przesiewowych genomu czeniu genu i u¿yciu z u¿yciem RNAi w liniach ma³ych inhibitorów Zastrze¿ona „tajemnicza” Leki przeciwko 8. Chen Y., Stamatoyannopoulos G., Song C.Z.: Downregulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 2003, 63, 4801-4804 9. Choi C.: RNAi works in monkeys. 2006, www.the-scientist.com/ 10.Coburn G.A., Cullen B.R.: Potent and specific inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by RNA interference. J. Vi- Rycina 4. Obszary rynku zwi¹zane z technologi¹ RNAi (31).
11.Coumoul X., Shukla V., Li C., Wang R.H., Deng C.X.: Conditional Z mo¿liwych do wyró¿nienia trzech typów technik knockdown of Fgfr2 in mice using Cre-LoxP induced RNA interfe- anty-mRNA, obejmuj¹cych jednoniciowe antysensowne oligonukleotydy, rybozymy i interferencjê RNA, ta ostat- 12.Couzin J.: RNAi safety comes under scrutiny, Science, 2006, 312, 1121 nia wydaje siê mieæ najlepsze perspektywy. O nieop³a- 13.Czauderna F., Santel A., Hinz M., Fechtner M., Durieux B., Fisch G., Leenders F., Arnold W., Giese K., Klippel A., Kaufmann J.: Inducible calnoœci technologii opartej na rybozymach mo¿e œwiad- shRNA expression for application in a prostate cancer mouse mo- czyæ firma Sirna Therapeutics, która powsta³a z Ribozy- me Pharmaceuticals, po tym jak kilka zaprojektowanych 14.Dillon C.P., Sandy P., Nencioni A., Kissler S., Rubinson D.A., Van leków nie spe³nia³o oczekiwañ. Przemiana firmy na skra- Parijs L.: RNAi as an experimental and therapeutic tool to study and ju bankructwa, posiadaj¹cej jedynie 2 miliony dolarów regulate physiological and disease processes. Annu. Rev. Physiol.
w gotówce, przynios³a w ci¹gu 18 miesiêcy a¿ 72 milio- 15.Echeverri C.J., Perrimon N.: High-throughput RNAi screening in ny dolarów od nowych inwestorów. Nawet je¿eli tylko cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Genet. 2006, 7, 373-384 niewielka czêœæ projektów opartych na RNAi znajdzie 16.Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T.: terapeutyczne zastosowanie, technologia ta mo¿e pro- Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Droso- wadziæ do miliardów dolarów zysku z nowych leków (65).
phila melanogaster embryo lysate. EMBO J. 2001, 20, 6877-6888 17.Frantz S.: Safety concerns raised over RNA interference. Nat. Rev.
1. Agrawal N., Dasaradhi P.V.N., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatna- 18.Gabryelska M., Nowak S., ¯ukiel R., Barciszewski J.: Interferencja RNA – gar R.K., Mukherjee S.K.: RNA interference: biology, mechanizm, nowa technologia w leczeniu nowotworów. Neuroskop 2005, 7, 27-38 and applications. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003, 67, 657-685 19.Gabryelska M., Nowak S., ¯ukiel R., Barciszewski J.: Uniwersalna 2. Amarzguioui M., Rossi J.J., Kim D.: Approaches for chemically syn- metoda inhibicji ekspresji genów – interferencja RNA. Na pograni- thesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 2005, 579, czu chemii i biologii 2005, Tom XII, 235-267 20.Gaur R.K.: RNA interference: a potential therapeutic tool for silencing spli- 3. B¹k D.: RNAi – interferencja RNA – skuteczny sposób na ciszê. Po- ce isoforms linked to human diseases. Biotechniques, 2006, 40, 15-22 21.Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J.: Inhibition of 4. Bitko V., Musiyenko A., Shulyayeva O., Barik S.: Inhibition of respi- influenza virus production in virus – infected mice by RNA interfe- ratory viruses by nasally administered siRNA, Nat. Med. 2005, 11, rence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 8676-8681 22.Glunde K., Raman V., Mori N., Bhujwalla Z.M.: RNA interference- 5. Cejka D., Losert D., Wacheck V.: Short interfering RNA (siRNA): tool mediated choline kinase suppression in breast cancer cells induces or therapeutic? Clin. Sci. 2006, 110, 47-58 differentiation and reduces proliferation. Cancer Res. 2005, 65, 6. Chang Y., Chang S.S., Lee H.H., Doong S.L., Takada K., Tsai C.H.: Inhibition of the Epstein-Barr virus lytic cycle by Zta-targeted RNA 23.Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Molas M., Boada J., Bermu- interference. J. Gen. Virol. 2004, 85, 1371-1379 dez J., Bartrons R., Perales J.C.: Overcoming diabetes-induced hy- 7. Charames G.S., Bapat B.: Cyclooxygenase-2 knockdown by RNA perglycemia through inhibition of hepatic phosphoenolpyruvate interference in colon cancer. Int. J. Oncol. 2006, 28, 543-549 carboxykinase (GTP) with RNAi. Mol. Ther. 2006, 13, 401-10 24.Grimm D., Streetz K.L., Jopling C.L., Storm T.A., Pandey K., Davis 44.Marques J.T., Devosse T., Wang D., Zamanian-Daryoush M., Serbi- C.R., Marion P., Salazar F., Kay M.A.: Fatality in mice due to oversa- nowski P., Hartmann R., Fujita T., Behlke M.A., Williams B.R.: turation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature A structural basis for discriminating between self and nonself do- uble-stranded RNAs in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 25.Gupta S., Schoer R.A., Egan J.E., Hannon G.J., Mittal V.: Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc.
45.McManus M.T., Sharp P.A.: Gene silencing in mammals by small Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 1927-1932 interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 2002, 3, 737-747 26.Hannon G.J., Rossi J.J.: Unlocking the potential of the human geno- 46.McRobert L., McConkey G.A.: RNA interference (RNAi) inhibits me with RNA interference. Nature 2004, 431, 371-378 growth of Plasmodium falciparum. Mol. Biochem. Parasitol. 2002, 27.Harper S.Q., Staber P.D., He X., Eliason S.L., Martins I.H., Mao Q., Yang L., Kotin R.M., Paulson H.L., Davidson B.L.: RNA interference 47.Mittal V.: Improving the efficiency of RNA interference in mammals, improves motor and neuropathological abnormalities in a Hunting- ton’s disease mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, 48.Mohmmed A., Dasaradhi P.V., Bhatnagar R.K., Chauhan V.S., Malho- tra P.: In vivo gene silencing in Plasmodium berghei-a mouse malaria 28.Heidenreich O.: Oncogene suppression by small interfering RNAs.
model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 309, 506-511 Curr. Pharm. Biotechnol. 2004, 5, 349-354 49.Oshima K., Kawasaki H., Soda Y., Tani K., Asano S., Taira K.: Maxi- 29.Higuchi M., Tsutsumi R., Higashi H., Hatekeyama M.: Conditional gene silencing utilizing the lac repressor reveals a role of SHP-2 in zymes and small hairpin-type RNAs that are driven by a tRNA pro- cagA-positive Helicobacter pylori pathogenicity. Cancer Sci. 2004, moter specifically cleave a chimeric gene associated with leukemia in vitro and in vivo. Cancer Res. 2003, 63, 6809-6814 30.Hosono T., Mizuguchi H., Katayama K., Xu Z., Sakurai F., Ishii-Wa- 50.Pai S.I., Lin Y.Y., Macaes B., Meneshian A., Hung C.F., Wu T.C.: tabe A., Kawabata K., Yamaguchi T., Nakagawa S., Mayumi T., Hay- Prospects of RNA interference therapy for cancer. Gene. Ther. 2006, akawa T.: Adenovirus vector-mediated doxycycline-inducible RNA interference. Hum. Gene Ther. 2004, 15, 813-819 51.Palliser D., Chowdhury D., Wang Q.Y., Lee S.J., Bronson R.T., Knipe 31.Howard K.: Unlocking the money-making potential of RNAi. Nat.
D.M., Liberman J.: An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection. Nature 2006, 439, 89-94 32.Hua J., Mutch D.G., Herzog T.J.: Stable suppression of MDR-1 gene 52.Park W.S., Hayafune M., Miyano-Kurosaki N., Takaku H.: Specific using siRNA expression vector to reverse drug resistance in a human HIV-1 gene silencing by small interfering RNAs in human peripheral uterine sarcoma cell line. Gynecol. Oncol. 2005, 98, 31-38 blood mononuclear cells. Gene Ther., 2003, 10, 2046-2050 33.Jackson A.L., Linsley P.S.: Noise amidst the silence: off-target effects 53.Putral L.N., Bywater M.J., Gu W., Saunders N.A., Gabrielli B.G., of siRNAs? Trends Genet. 2004, 20, 521-524 Leggatt G.R., McMillan N.A.J.: RNAi against HPV oncogenes in ce- 34.Jiang M., Arzumanov A.A., Gait M.J., Milner J.: A bi-functional siRNA rvical cancer cells results in increased sensitivity to cisplatin. Mol.
construct induces RNA interference and also primes PCR amplifica- tion for its own quantification. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e151 54.Raoul C., Abbas-Terki T., Bensadoun J., Guillot S., Haase G., Szulc 35.Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MabLachlan I.: J., Henderson C.E., Aebischer P.: Lentiviral-mediated silencing of Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune SOD1 through RNA interference retards disease onset and progres- response by synthetic siRNA. Nat. Biotechnol. 2005, 23, 457-462 sion in a mouse model of ALS. Nat. Med. 2005, 11, 423-428 36.Kim. D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J.: Inter- 55.Robbins M.A., Li M., Leung I., Li H., Boyer D.V., Song Y., Behlke feron induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage poly- M.A., Rossi J.J.: Stable expression of shRNAs in human CD34+ pro- merase. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 321-325 genitor cells can avoid induction of interferon responses to siRNAs in vitro. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 566-571 37.Konstantinova P., de Vries W., Haasnoot J., ter Brake O., de Haan P., Berkhout B.: Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 by RNA 56.Robinson R.: RNAi Therapeutics: How likely, how soon? PloS Biol.
interference using long-hairpin RNA. Gene Ther. 2006, 13, 1403-13 38.Kurreck J.: Antisense technologies. Improvement through novel che- 57.Ruttimann J.: RNA therapy tackles eye disease. Nature 2006, www.na- mical modifications. J. Biochem. 2003, 270, 1628-1644 ture.com/ news/2006/060605/pf/060605-4.html 39.Lau N.C., Bartel D.P.: Cenzorzy genów. Œwiat Nauki, 2003, 145, 34-41 58.Saksela K.: Human viruses under attack by small inhibitory RNA.
40.Li B., Tang Q., Cheng D., Qin C., Xie F.Y., Wei Q., Xu J., Liu Y., Zheng B., Woodle M.C., Zhong N., Lu P.Y.: Using siRNA in prophy- 59.Sandy P., Ventura A., Jacks T.: Mammalian RNAi: a practical guide.
lactic and therapeutic regimans against SARS coronavirus in Rhesus 60.Scherr M., Eder M.: RNAi in functional genomics. Curr. Opin. Mol.
41.Li Y.C., Kong L.H., Cheng B.Z., Li K.S.: Construction of influenze virus siRNA expression vectors and their inhibitory effects on multi- 61.Sioud M.: RNA interference below the immune radar. Nat. Biotech- plication of influenza virus. Avian Dis. 2005, 49, 562-573 42.MacRae I.J., Zhou K., Li F., Repic A., Brooks A.N., Cande W.Z., Adams 62.Skipper M.: RNA interference. Have our dreams been shattered? Nat.
P.D., Doudna J.A.: Structural Basis for Double-Stranded RNA Pro- cessing by Dicer. Science 2006, 311, 195-198 63.Sledz C.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R.: 43.Makimura H., Mizuno T.M., Mastaitis J.W., Agami R., Mobbs C.V.: Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat.
Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases meta- bolic rate and decreases body weight without influencing food inta- 64.Stevenson M.: Therapeutic potential of RNA interference. N. Engl. J.
65.Stipp D.: Biotech’s billion dollar breakthrough. A technology called 79.Zhang W., Yang H., Kong X., Mohapatra S., Juan-Vergara H.S., Hel- RNAi has opened the door to major new drugs. Already it’s revolu- lermann G., Behera S., Singam R., Lockey R.F., Mohaptra S.S.: Inhibi- tionizing gene research. Fortune 2003, 147, 96 tion of respiratory syncytial virus infection with intranasal siRNA na- 66.Stix G.: Kto wy³¹czy geny? Œwiat Nauki 2004, 159, 72-75 noparticles targeting the viral NS1 gene. Nat. Med. 2004, 11, 56-62 67.Syhan A.A., Vlassov A.V., Ilves H., Egry L., Kaspar R.L., Kazakov S.A., 80.Zhang X.N., Xiong W., Wang J.D., Hu Y.W., Xiang L., Yuan Z.H.: Johnston B.H.: Complete, gene-specific siRNA libraries: production siRNA-mediated inhibition of HBV replication and expression. World and expression in mammalian cells, RNA 2005, 11, 837-46 68.Tuschl T., Borkhardt A.: Small interfering RNAs: a revolutionary tool 81.Zhang Y., Wang Y., Gao W., Zhang R., Han X., Jia M., Guan W.: for the analysis of gene function and gene therapy. Mol. Interv. 2002, Transfer of siRNA against XIAP induces apoptosis and reduces tu- mor cells growth potential in human breast cancer in vitro and in vivo. Breast Cancer Res. Treat. 2006, 96, 267-277 69.Uprichard S.L.: The therapeutic potential of RNA interference. FEBS 82.Zhang Y., Zhang Y.F., Bryant J., Charles A., Boado R.J., Pardridge W.M.: Intravenous RNA interference gene therapy targeting the hu- 70.Wang S., Chai Y.B., Liu F., Zhang X.Y., Jia W., Xie X., Yu W.Q., Shang man epidermal growth factor receptor prolongs survival in intracra- Z.C., Jin B.Q., Sun B.Z.: Effect of specific siRNA targeting against nial brain cancer. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 3667-3677 bcr-abl chimeric gene on chronic myelogenous leukemia cells. Zhon- 83.Zimmerman T.S., Lee A.C.H., Akinc A., Bramlage B., Bumcrot D., Fedoruk M.N., Harborth J., Heyes J.A., Jeffs L.B., John M., Judge A.D., 71.Wang W., Wang C.Y., Dong J.H., Chen X., Zhang M., Zhao G.: Iden- Lam K., McClintock K., Nechev L.V., Palmer L.R., Racie T., Rohl I., tification of effective siRNA against K-ras in human pancreatic can- Seiffert S., Shanmugam S., Sood V., Soutschek J., Toudjarska I., Whe- cer cell line MiaPaCa-2 by siRNA expression cassette. World J. Ga- at A.J., Yaworski E., Zedalis W., Koteliansky V., Manoharan M., Vorn- locher H.P., MacLachlan I.: RNAi-mediated gene silencing in non- 72.Wiebusch L., Truss M., Hagemeier C.: Inhibition of human cytome- human primates. Nature 2006, 441, 111-114 galovirus replication by small interfering RNAs. J. Gen. Virol. 2004, 84.¯ukiel R., Nowak S., Wyszko E., Rolle K., Gawroñska I., Barciszew- ska M.Z., Barciszewski J.: Suppression of human brain tumor with 73.Wiznerowicz M., Trono D.: Conditional suppression of cellular ge- interference RNA specific for Tenascin-C. Cancer Biol. Ther. 2006, nes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J.
74.Wu C.J., Huang H.W., Liu C.Y., Hong C.F., Chan Y.L.: Inhibition of SARS-CoV replication by siRNA. Antiviral Res. 2005, 65, 45-48 75.www.clinicaltrials.gov76.Yoon J.S., Kim S.H., Shin M.C., Hong S.K., Jung Y.T., Khang I.G., Shin W.S., Kim C.C., Paik S.Y.: Inhibition of herpesvirus-6B RNA replication by short interference RNAs, J. Biochem. Mol. Biol. 2004, 77.Zentilin L., Giacca M.: In vivo transfer and expression of genes co- ding for short interfering RNAs. Curr. Pharm. Biotechnol. 2004, 4, 78.Zhang M., Zhang X., Bai C.X., Song X.R., Chen J., Gao L., Hu J., Hong Q.Y., West M.J., Wei M.Q.: Silencing the epidermal growth factor re- Katedra i Klinika Neurochirurgii i Neurotraumatologii A.M.
ceptor gene with RNAi may be developed as a potential therapy for non small lung cancer. Genet. Vaccines Ther. 2005, 30, 3-5

Source: http://www.neurochirurgia.amp.edu.pl/neuroskop/n08/30.pdf

Icid(g)- meclo 3 column

Activity of Meclocycline Sulfosalicylate Tested ICID 2006 Against Oral Pathogens RN JONES, TR FRITSCHE, HS SADER, PR RHOMBERG JMI Laboratories, North Liberty, Iowa, USA A M E N D E D A B S T R A C T ¥ Meclocycline SS was markedly superior to¥ Anaerobes (Table 2) were very susceptible tomeclocycline SS with 23 of 27 strains inhibited Background: Meclocycline sulfosalicylate

chinese.eurekalert.org

of the authors and THE JOURNAL and not those of Failure of Estrogen Plus Progestin Therapy for Prevention Suzanne W. Fletcher, MD, MSc The WHI is the first randomized primary prevention trialof postmenopausal hormones, and the part of the study thatcompared estrogen/progestin with placebo was terminatedearly. The data and safety monitoring board (DSMB) rec-PPROXIMATELY 38% OF POSTMENOPAUSAL

Copyright © 2010-2014 Medical Articles