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DETERMINACIÓN DE NIVELES RESIDUALES DE TETRACICLINA EN
CANALES BOVINAS POR LA TÉCNICA DE ELISA EN EL FRIGORÍFICO
FRIOGAN (LA DORADA)
DETERMINATION OF RESIDUAL
TETRACYCLINE LEVELS IN
En las políticas sanitarias colombianas se BOVINE CARCASSES BY MEANS
estableció la importancia del control de residuos OF ELISA IN THE FRIOGAN
de medicamentos veterinarios, considerando la SLAUGHTERHOUSE (LA DORADA,
preocupación mundial por sus implicaciones CALDAS, COLOMBIA)
en salud pública. El trabajo buscó detectar y cuantificar las concentraciones de residuos de tetraciclinas en músculo de 114 animales VDFULÀFDGRVHQ)5,2*$1 (La Dorada, Caldas) ABSTRACT
por ELISA, siendo referencia los LMR de la Unión Europea (100 ppb) y del Codex Alimentarius The Colombian sanitary policies have established (200 ppb). El 61,5% de las muestras presentaron the importance in the control of veterinary concentraciones superiores a 100 ppb y el 23,7% medicines residues, considering the world-wide a 200 ppb. Los resultados sugieren que fallan concern due to its public health implications. las Buenas Prácticas en la Administración de The objective of this research was to detect Medicamentos en la producción primaria y que and to quantify, by means of ELISA, the existen falencias en la inocuidad cárnica.
tetracycline residue concentrations in the muscle of 114 slaughtered animals at the Friogan Palabras clave: LMR, residuo de medicamento, slaughterhouse (La Dorada-Caldas), using the
tetraciclina, inocuidad, ELISA.
MRL of the European Union (100 ppb) and the Codex Alimentarius (200 ppb) as reference. The results showed that 61.5% of the samples presented concentrations above 100 ppb and 23.7% above 200 ppb. These results suggest that WKH*RRG3UDFWLFHVRI0HGLFLQH$GPLQLVWUDWLRQare failing, and that there are errors in meat innocuousness.
Key words: MLR, medicine residues,
tetracycline, innocuousness, ELISA.
1 Estudiante del Programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Caldas. A.A. 275, Manizales, Caldas, Colombia. Tel: (6) 8781516, e-mail: [email protected] Profesor Departamento de Salud Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas. A.A. 275, Manizales, Caldas, Colombia. Tel: (6) 8781516, e-mail: [email protected] Profesor Departamento de Química, Universidad de Caldas. A.A. 275, Manizales, Caldas, Colombia. Tel: (6) 8781500, e-mail: [email protected]¿QDQFLDGRSRUOD9LFHUUHFWRUtDGH,QYHVWLJDFLRQHVGHOD8QLYHUVLGDGGH&DOGDV 5HFLELGRQRYLHPEUHGH$FHSWDGRGLFLHPEUHGH %LRVDOXG9ROXPHQHQHURGLFLHPEUHSiJV Jackeline Franco, Marlyn Romero Peñuela, Gonzalo Taborda INTRODUCCIÓN
adición de dosis subterapéuticas en el alimento GHOJDQDGRFRQÀQHVSURÀOiFWLFRV En Colombia actualmente se busca implementar una política sanitaria y de inocuidad para la En la literatura se han descrito diversos métodos cadena de la carne bovina, cuyo objetivo es analíticos para la estimación de residuos de proteger la salud pública y la sanidad animal, antibióticos. De acuerdo con la comisión del aumentar la competitividad del sector productivo &RGH[ $OLPHQWDULXV  VH FODVLÀFDQ HQ WUHVy fortalecer la admisibilidad de sus productos en tipos: Tipo I, Tipo II y Tipo III. los mercados internacionales (1, 2). Los métodos analíticos Tipo I, denominados 'HQWURGHORVOLPLWDQWHVLGHQWLÀFDGRVHQPDWHULD PpWRGRV GH UHIHUHQFLD R FRQÀUPDWRULRV VRQGH LQRFXLGDG VH HQFXHQWUD OD GHÀFLHQFLD GHO aquellos que ofrecen el mayor grado de sistema de inspección, vigilancia y control para FRQÀDELOLGDGHQODFXDQWLÀFDFLyQHLGHQWLÀFDFLyQLGHQWLÀFDU FRQWURODU \ SUHYHQLU ORV SHOLJURV del analito (14), entre los cuales se encuentra la biológicos, ambientales y químicos de la cadena cromatografía combinada con espectrometría de agroalimentaria cárnica (2). Con relación a los masa, detector de arreglo de diodos o detector de peligros químicos, es de resaltar la importancia ÁXRUHVFHQFLD(O/tPLWHGH'HWHFFLyQ/'de los medicamentos veterinarios, por su amplio GHHVWHPpWRGRHVWiHVWLPDGRHQWUH\ǍJuso en la producción primaria con propósitos kg-1, dependiendo si el analito es oxitetraciclina,WHUDSpXWLFRV SURÀOiFWLFRV \R SURGXFWLYRV  tetraciclina, clortetraciclina o doxiciclina, y la    FRPR WDPELpQ SRU OD SUHVHQFLD GH ORV recuperación que pueden alcanzar estos métodos residuos o sus metabolitos, que pueden estar oscila entre 97% y 107% (16, 17). A pesar de su presentes en la carne y otros tejidos, cuando su alto desempeño, presentan como desventaja la uso es inapropiado (6). GLÀFXOWDGSDUDDQDOL]DUJUDQGHVYRO~PHQHVGHmuestras en cortos periodos de tiempo, lo que Los residuos de estas sustancias o sus es indispensable para llevar a cabo programas metabolitos en la carne u otros alimentos de de vigilancia y control (15). origen animal, pueden causar efectos adversos a los consumidores como hipersensibilidad (3, Los métodos Tipo II, permiten determinar la 7), inhibiciones terapéuticas (8) y resistencia FRQFHQWUDFLyQGHODQDOLWRSHURQRVXLGHQWLÀFDFLyQmicrobiana (9, 10, 11, 12). De otra parte, algunos exacta, por lo que se requiere realizar un medicamentos usados como promotores de segundo análisis para dicha determinación (14). crecimiento pueden afectar la calidad de la carne, Entre ellos se encuentra la cromatografía líquida porque incrementan la producción de tejido FRQGHWHFWRU89\ODFURPDWRJUDItDHQFDSDÀQDconectivo y la fracción insoluble de colágeno (10, 15). Ésta permite analizar simultáneamente intermuscular, disminuyendo la terneza (3). Se varias muestras sobre la misma placa, con un KDGHVFULWRDGHPiVTXHLQWHUÀHUHQHQDOJXQRV costo relativamente bajo, y una selectividad y procesos de fermentación de la carne, esenciales sensibilidad aceptables. Sin embargo, requiere en la industrialización de los productos cárnicos laboriosas etapas de tratamiento de muestra y madurados (10).
SXULÀFDFLyQFRQHOÀQGHHYLWDULQWHUIHUHQFLDVlo que incrementa el tiempo de análisis y su Uno de los principales residuos de antibióticos costo (16). evaluados en alimentos son los del grupo de las tetraciclinas (7), porque son ampliamente usados El Tipo III de los métodos analíticos, son por su capacidad bacteriostática contra una aquellos que determinan ausencia o presencia gran variedad de microorganismos patógenos, de un compuesto y se denominan de tamizaje para el tratamiento de mastitis en bovinos o en o de barrido (14). En esta categoría se incluyen %LRVDOXG9ROXPHQHQHURGLFLHPEUHSiJV Determinación de niveles residuales de tetraciclina en canales bovinas por la técnica de ELISA.
los métodos microbiológicos y los ensayos de Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) (1, inhibición de enzimas. Dichos métodos son 2, 20). También, planteó mejorar la capacidad los más útiles en los programas de control diagnóstica en inocuidad con planes de muestreo por su capacidad de manejar un alto número y equipos de alta tecnología que amplíen de muestras, comodidad y bajo costo (15, el espectro de detección (1, 2), acciones que 18). Los métodos microbiológicos, han sido vienen siendo adelantadas por el Laboratorio tradicionalmente empleados para la detección Nacional de Insumos Pecuarios (LANIP) (20). de residuos de antibióticos y se basan en Además, se han promulgado decretos para la la inhibición del crecimiento bacteriano, creación y puesta en funcionamiento del Plan principalmente del Bacillus Stearothermophilus, Nacional de Residuos, reglamentación acerca y B. Subtilis sembrado en un medio con pH de medicamentos veterinarios y contaminantes 6, tiene un LD de 1 ng para doxicilina, 8 ng químicos no autorizados en ganado que son para oxitetraciclina y 5 ng para tetraciclina (17). regulados con base en el Codex Alimentarius Estos métodos microbiológicos son menos (20).
HVSHFtÀFRV\VHQVLEOHVTXHORVEDVDGRVHQWpFQLFDVinmunoquímicas, porque existen múltiples A pesar de este esfuerzo legislativo, aún se sustancias que pueden ocasionar inhibición desconoce el estatus sanitario actual del país bacteriana, pudiendo generar falsos positivos en materia de residuos de antibióticos (20, 21), (16). Respecto a los ensayos inmunoquímicos, y no se cuenta con sistemas de diagnóstico el formato más usado para la determinación de HVWDEOHFLGRVSDUDGLFKRÀQ3ULQFLSDOPHQWHresiduos es el ELISA, ha sido descrito como la porque las investigaciones y determinaciones técnica más práctica para el tamizaje de residuos de la residualidad en Colombia no habían TXtPLFRVHQDOLPHQWRV\PDWHULDOHVELROyJLFRV correspondido a una política nacional sino a presenta valores de sensibilidad altos, teniendo esfuerzos aislados y esporádicos de particulares HQFXHQWDTXHORVOtPLWHVGHGHWHFFLyQFRQÀDEOHV y de diferentes universidades que buscaban de este procedimiento se sitúan en rangos de 6 realizar aportes al estudio de esta problemática a 60 ppb, también es selectivo, sencillo, rápido (20, 21). y de bajo costo (16). La FDA ()RRG DQG 'UXJV$GPLQLVWUDWLRQ $JHQF\) incluye esta técnica Se evidencia así la necesidad de desarrollar HQ OD OLVWD GH SURFHGLPLHQWRV RÀFLDOHV SDUD OD HVWXGLRVTXHFRQVWLWX\DQXQVRSRUWHFLHQWtÀFRdeterminación de tetraciclinas en productos para el desarrollo de programas de vigilancia y comestibles (19).
control de residuos químicos en los alimentos destinados al consumo nacional y para Atendiendo la necesidad de asegurar los exportación (20). Motivo por el cual, se planteó estándares sanitarios internacionales por como objetivo del presente trabajo detectar y parte de los productos pecuarios colombianos, FXDQWLÀFDUORVUHVLGXRVGHHVWRVDQWLPLFURELDQRVse está actualizando la legislación sanitaria en músculo diafragmático de ganado bovino del país relacionada con la residualidad de EHQHÀFLDGR HQ )5,2*$1 (La Dorada), dando medicamentos (20, 21). En el año 2005, el un soporte al diagnóstico de la situación con Consejo Nacional de Política Económica y respecto a los Límites Máximos de Residuos Social de Colombia (CONPES) estableció (LMR) establecidos internacionalmente por como política de la cadena cárnica y láctea, el el Codex Alimentarius (CA) (22) y la Unión GHVDUUROOR GH SURJUDPDV RÀFLDOHV GH FRQWURO Europea (UE). También se buscó relacionarlos de residuos y contaminantes químicos a con la presencia de lesiones meritorias de cargo del Instituto Nacional de Vigilancia de decomiso.
Medicamentos y Alimentos (INVIMA) y del Jackeline Franco, Marlyn Romero Peñuela, Gonzalo Taborda MATERIALES Y MÉTODOS
centrifugados se mezclaron y se pasaron a WUDYpV GH SDSHO ÀOWUR HVWH ÀOWUDGR VH SXULÀFymediante columnas de extracción en fase sólida SPE (5,'$Š&FROXPQ55%LRSKDUP$*'DUPVWDGW*HUPDQ\), previamente activadas con En julio de 2007, se tomaron un total de 138 metanol al 100% y agua destilada grado reactivo. muestras de músculo diafragmático de bovinos El residuo se eluyó con ácido oxálico/metanol VDFULÀFDGRVHQ)5,2*$1 ()ULJRUtÀFRV*DQDGHURV (1,8 g/L).
GH&RORPELD6$), situado en La Dorada (Caldas).
Se realizó un muestreo aleatorio simple de los Ensayo Inmunoabsorbente Ligado A Enzima
ORWHVTXHLQJUHVDURQGLDULDPHQWHDOIULJRUtÀFR (ELISA)
GH DFXHUGR D OD QRUPD &$&*/  GHOCA (23). Se escogieron 4 lotes al azar, que La determinación cuantitativa de tetraciclina comprendían animales de la misma procedencia se realizó mediante enzimoinmunoensayo y el mismo sexo. Usando como referencia un 95% competitivo en microplaca de kit comercial de probabilidad para detectar una incidencia de de ELISA (5LGDVFUHHQŠ 7HWUDF\FOLQ), donde los residuos no conformes en el lote del 10%, se los contenedores de la microplaca estaban tomaron 29 muestras primarias por cada lote recubiertos con proteína conjugada. A éstos, se seleccionado. A los animales seleccionados se les adicionaron en orden: la muestra o los estándares, realizó la inspección ante-mortem y post-mortem, el anticuerpo de anti-tetraciclina, un conjugado cuyos resultados se registraron en el formato de anticuerpo marcado con enzima, el sustrato, \ÀQDOPHQWHHOFURPyJHQR/DDGLFLyQGHXQDsolución stop cambió el azul en amarillo, lo que Siguiendo el procedimiento establecido permitió su determinación espectrofotométrica por el CA (23), que permite el análisis de a 450 nm. Las microplacas se montaron con productos primarios como la carne o productos 6 estándares para la curva de calibración, un alimenticios considerados despojos –como EODQFRGHPXHVWUD\GRVPXHVWUDVIRUWLÀFDGDV
el hígado y los riñones–, se recolectaron 500 La lectura de la prueba se realizó en lector de
gramos de músculo diafragmático bovino, de ELISA (0XOWLVNDQ(;/DEV\VWHP).
acuerdo a las recomendaciones del fabricante
del kit comercial de ELISA utilizado. Las Validación
muestras se almacenaron en bolsas herméticas y se mantuvieron congeladas a -20°C hasta su 6HSUHSDUDURQFXDWURVVROXFLRQHVIRUWLÀFDGRUDV (150 ppb, 100 ppb, 50 ppb y 20 ppb). Éstas fueron añadidas a muestras previamente Procesamiento de la muestra
homogeneizadas y pesadas de músculo de feto de ternero a término, de una vaca gestante 114 de las muestras de músculo diafragmático al momento del sacrificio. Estas soluciones se analizaron con el kit de ELISA comercial se mantuvieron a -20ºC. La validación de la (5LGDVFUHHQŠ 7HWUDF\FOLQ 5%LRSKDUP $* técnica se realizó utilizando un kit de ELISA 'DUPVWDGW*HUPDQ\), siguiendo las instrucciones (5LGDVFUHHQŠ7HWUDF\FOLQ), dividido en partes del fabricante. Después de descongelar a iguales y montados en momentos diferentes. temperatura ambiente la muestra de músculo
diafragmático, se eliminó la grasa y se Análisis Estadístico
homogeneizó. De esta matriz se tomaron 5 gramos (g) y se mezcló con 25 mililitros (ml) de Se construyó una base de datos en (;&(/ 6.0. EXIIHU0FOOYDLQ. A continuación, se agitó durante Para la validación estadística de los resultados 20 minutos y se centrifugó por 10 minutos, se utilizó la estadística descriptiva usando el repitiendo dos veces el proceso. Los extractos programa :,1(3,6&23( 2.0.
%LRVDOXG9ROXPHQHQHURGLFLHPEUHSiJV Determinación de niveles residuales de tetraciclina en canales bovinas por la técnica de ELISA.
RESULTADOS
Tabla 1. Distribución de las muestras de acuerdo
Para establecer los niveles de aceptación de las su concentración de residuos de oxitetracilina en muestras evaluadas se tomaron como referencia partes por billón (ppb).
los LMR recomendados por el CA (200 ppb) y la UE (100 ppb). La técnica ELISA permitió Concentración ( ppb)
LGHQWLÀFDUDOJXQRGHORVSULQFLSLRVGHOJUXSRGH las tetraciclinas en las 114 muestras evaluadas De acuerdo a los criterios anteriormente PHQFLRQDGRVHOQ GHODVPXHVWUDV oxitetraciclina superaron el LMR de la UE y HO  Q  H[FHGLHURQ HO OtPLWH GHO &$ 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 97 101 105 109 113
muestras
Figura 1. Concentraciones detectables de oxitetraciclina en la muestras de músculo diafragmático
en comparación con el LMR establecido por la Unión Europea (100 ppb).
Jackeline Franco, Marlyn Romero Peñuela, Gonzalo Taborda 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 97 101 105 109 113
muestras
Figura 2. Concentraciones detectables de oxitetraciclina en la muestras de músculo diafragmático
en comparación con el LMR establecido por el Codex Alimentarius (200 ppb).
El grupo evaluado pertenecía a la raza cebú en la inspección post-mortem, con dictamen de y procedía de sistemas productivos de ceba. decomiso parcial. Estuvo conformado por 48 novillos, 35 toretes, 5 toros y 26 vacas. De las muestras que presentaron un nivel de UHVLGXRV VXSHULRUHV D  SSE Q  D  VH (OGHORVDQLPDOHVQ QRSUHVHQWy les efectuó decomiso parcial por lesiones como lesiones macroscópicas meritorias de decomiso, HQÀVHPDQHXPRQtD\SXOPyQKHPRUUiJLFR\PLHQWUDV TXH HO  UHVWDQWH Q  en menor medida a absceso hepático, edema, presentó problemas respiratorios y hepáticos cirrosis y regurgitación (Tabla 3). Tabla 3. Correlación de la condición contra el diagnóstico de la inspección.
((QÀVHPD$+$EVFHVR+HSiWLFR11HXPRQtD('(GHPD3+3XOPyQ+HPRUUiJLFR55HJXUJLWDFLyQ&&LUURVLV191RYLOOR %LRVDOXG9ROXPHQHQHURGLFLHPEUHSiJV Determinación de niveles residuales de tetraciclina en canales bovinas por la técnica de ELISA.
DISCUSIÓN
con valores por encima de los LMR y 36 muestras con niveles críticos o en límites tolerables. En el presente trabajo se observó una alta proporción de muestras con concentraciones Es de resaltar que la presencia de residuos de superiores a los LMR utilizados como punto de oxitetraciclina superiores a los LMR en músculo referencia, donde 61,1% fueron superiores a 100 diafragmático fue más frecuente en animales sin ppb y 23,75% a 200 ppb. Esto concuerda con los lesiones macroscópicas comparados con aquellos resultados presentados por Muriuki et al. (24), que presentaron alguna lesión (Tabla 2), esto fue quienes obtuvieron un 20% de las muestras con concordante con los resultados presentados por residuos de oxitetraciclina superiores a 200 ppb *HVFKH\(PLOIRUN(VWHIHQyPHQRVHSXHGHHQ FLQFR SODQWDV GH EHQHÀFLR GH OD FLXGDG GH vincular a que en los procesos infecciosos se Nairobi. También corresponde a los resultados puede encontrar residuos de antibióticos a nivel de Arango (2001) (25), quien estableció la renal o hepático por ser órganos a los que un presencia de estos mismos residuos en leche medicamento llega rápidamente por dinámica cruda y pasteurizada en la ciudad de Manizales, farmacológica, mientras que en animales mediante el uso de la técnica de difusión tratados por periodos de tiempo prolongados ya estándar 'HOYRWHVW. De un total de 111 muestras se han desarrollado depósitos musculares. analizadas, se obtuvieron 26 muestras (23,4%) Tabla 2. Presencia de concentraciones de oxitetraciclina superiores a LMR en músculo
diafragmático de acuerdo con la inspección post-mortem.
Los resultados del presente trabajo sugieren autoridades de salud pública mundial relacionada que en los sistemas de producción primaria con el uso inadecuado de antibióticos en se están incumpliendo las buenas prácticas animales de abasto público, que ha propiciado en la administración de medicamentos, y el surgimiento y la diseminación de bacterias y TXH ODV SODQWDV GH EHQHÀFLR QR FXHQWDQ FRQ genes resistentes que pueden ser transmitidos un sistema de inspección sanitaria de la de animales a humanos a través de la cadena carne basada en el análisis de riesgo (27). A alimenticia (9, 12, 28). Teniendo en cuenta pesar de que la legislación colombiana ha que ciertos antibióticos empleados en los actualizado la normatividad relacionada con la animales son idénticos o están relacionados inocuidad de la cadena cárnica y ha propuesto con los utilizados en medicina humana, la desarrollar el Plan Nacional de Control de UHVLVWHQFLDEDFWHULDQDFRQÀHUHPD\RUYLUXOHQFLDResiduos de Medicamentos Veterinarios a los microorganismos implicados en relación y Contaminantes para la carne (2), aún se con las infecciones de bacterias susceptibles desconoce la problemática real relacionada con (9, 11, 28). Se ha reconocido este fenómeno, los residuos de los medicamentos veterinarios principalmente en bacterias causantes de y sus implicaciones en la salud pública.
enfermedades transmitidas por alimentos como la Salmonella, &DPS\OREDFWHU, y (VFKHULFKLDFROL(8, Es necesario hacer énfasis en que actualmente 11, 12, 28). existe una preocupación por parte de las Jackeline Franco, Marlyn Romero Peñuela, Gonzalo Taborda CONCLUSIONES
deben acompañar este esfuerzo, limitando la venta y distribución de antibióticos sin Los resultados nos permiten sugerir que prescripción médica, estableciendo programas es necesario fortalecer la implementación de vigilancia epidemiológica, estrategias de de las Buenas Prácticas Pecuarias (BPP), educación para los productores y los veterinarios para minimizar el riesgo en la producción (11).
primaria (29). Así mismo, se debe reducir la necesidad de administrar antibióticos, mediante el mejoramiento de las prácticas de higiene y AGRADECIMIENTOS
GH FRQWURO GH HQIHUPHGDGHV   VLHQGRnecesario además, el compromiso por parte Los autores quieren expresar su agradecimiento de los veterinarios y los productores para el a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados uso prudente de los antibióticos, por una parte de la Universidad de Caldas, al Laboratorio de soportado en las técnicas de diagnóstico de Producción Porcina de la Universidad de Caldas, enfermedades, y por el otro por la optimización al Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) de las buenas prácticas de producción y el respeto Seccional Manizales, al Laboratorio Nacional a los tiempos de retiro establecidos para cada GH,QVXPRV3HFXDULRV/$1,3\DO)ULJRUtÀFRmedicamento (9, 28). Las políticas nacionales )5,2*$1 (La Dorada). REFERENCIAS
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Source: http://biosalud.ucaldas.edu.co/downloads/Revista7_5.pdf